МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ СТАБИЛЬНЫХ ИЗОТОПОВ В КОНТРОЛЕ ПОДЛИННОСТИ, КАЧЕСТВА И СОСТОЯНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

Г.А.Калабин, М.И.Токарев, Ю.С.Ходеев.

Экологический факультет РУДН, Москва

Комиссия по масс-спектрометрии РАН, Москва

Cовременный мир ставит перед человеком и обществом множество вопросов, ответы на которые могут дать только инструментальные аналитические методы. Целый ряд вопросов, и среди них важнейшие, по силам только одному методу - масс-спектрометрии стабильных изотопов. Именно он может дать заключение о подлинности напитков (соки, пиво, вино, шампанское, водка, коньяк, виски), о качестве пищевых добавок (натуральные они или синтетические), о чистоте продуктов (мед, оливковое масло), о происхождении этилового спирта (пищевой или синтетический) и даже об инфицированности человека бактериями, вызывающими заболевания желудочно-кишечного тракта.

В таблице 1 приведены стабильные изотопы легких элементов и их содержание в природе (в атомных %).

                                                                                                                Таблица 1

Стабильные изотопы основных элементов органических молекул

Элемент      Изотоп      Содержание, %

 

                Водород                1Н                            99.983

                                                2Н                              0.014

                Углерод                12С                          98.916

                                                13С                            1.084

                   Азот                    14N                          99.916

                                                15N                            0.366

                Кислород              16О                          99.758

                                                17О                            0.038

                                                18О                            0.204

По своим химическим свойствам изотопы одного и того же элемента неразличимы, но в результате химических и физических процессов возникает изотопный эффект, заключающийся в небольшом изменении изотопного состава конечного продукта по сравнению с исходным. Именно измерения малых вариаций изотопного состава (ИС) во многих случаях стали инструментом выявления фальсифицированных продуктов и установления источников происхождения товаров или сырья. Измерения малых вариаций представляют в единицах дельта (d):

d = [(Rпробы/Rстандарта) - 1] х 103,

где R – отношение количеств двух измеряемых изотопов. Современные масс-спектрометры дают возможность измерять ИС с точностью, достигающей 10-7. Для примера: ИС углерода в так называемом PDB-стандарте (СаСО3 в одном из месторождений в Калифорнии), измеренный с помощью специализированного масс-спектрометра, составляет 98.8887672 ат. % 12С и 1.1112328 ат. % 13С, что соответствует R = 13C/12C = 0.0112372. Для стандартов кислорода, водорода и азота ИС измерен с такой же точностью. Проблема изотопии углерода возникла в связи со стремлением точно измерить его изотопный состав в природе, поскольку через углерод рассчитывались атомные веса элементов. Оказалось, что ИС окисленного углерода (атмосферный углекислый газ, карбонаты) заметно отличается от восстановленного углерода (природные органические вещества): восстановленный углерод обеднен более тяжелым изотопом 13С. Исходным пунктом объяснения этого различия выступает очевидный факт, что первоисточником углерода в органических соединениях является углекислый газ атмосферы, а поставщиками восстановленного углерода - растения: трава, мох, кустарники, деревья и т.д. Растения (и только растения) поглощают углерод из воздуха, в котором он содержится в виде СО2.

Установлено, что имеется три механизма фотосинтеза. Каким из трех механизмов "пользуется" растение, зависит от ряда факторов: содержание СО2 в местах произрастания, климатические условия, длина светового дня. Механизмы объединяет общий принцип: каталитический фотосинтез,  где в роли катализатора выступают ферменты, уникальные по своей избирательности. Этим свойством ферментов определяется изменение ИС углерода в растениях по сравнению с ИС исходного углекислого газа. При связывании СО2 происходит обогащение углерода более легким изотопом с массовым числом 12. Можно предположить, что в процессе эволюции "экономная" природа создала такие ферменты-катализаторы, которые приспособлены для "работы" с изотопом 12С: его гораздо больше (99%), чем 13С в исходном углероде. Обогащение легким изотопом приводит к отрицательным значениям d. Отрицательные величины d характерны и для остальных рассматриваемых элементов, если они «прошли» через стадию их усвоения растениями.

Наиболее распространенный механизм усвоения углерода носит название цикла Кельвина и обозначается С3. Подавляющее большинство деревьев, кустарников и трав усваивают углекислый газ из атмосферы именно по этому механизму. Другой механизм (С4) называется циклом Хетча-Слека. Типичные представители такого механизма - сахарный тростник и кукуруза. Некоторые растения, произрастающие в жарком и сухом климате, используют механизм САМ. Характерные представители растений, "работающих" по механизму САМ, это кактусы и ананасы.

На рисунке показан ИС углерода в различных объектах. О погрешности измерений можно судить по ИС углерода в углекислом газе атмосферы над океаном. Поэтому приводимый интервал ИС связан с разбросом результатов от пробы к пробе, и основной вклад в интервал вносят пробы, взятые в различных географических регионах. Внутри региона разброс в ИС незначителен. Похожая картина имеет место для изотопов О2 и Н2.

Подпись:
Интервалы ИС углерода растений классов С3 и С4 вне зависимости от региона не перекрываются (см. рисунок). Не перекрывается ИС углерода европейца и американца. В случае нефти и каменного угля средний ИС углерода близок к растениям класса С3. Это может свидетельствовать о большом количестве свободного углекислого газа в период их образования, поскольку к таким условиям максимально приспособлен механизм С3.

Благодаря детальному изучению изотопии углерода она наиболее широко используется для целей тестирования. В ряде случаев весьма полезным дополнением выступает одновременное измерение изотопного состава азота и кислорода.

Работы по применению изотопного анализа к продуктам питания и другим объектам для целей контроля их качества и установления источника происхождения особенно широко развернулись после оснащения изотопного масс-спектрометра хроматографом и микропечью для сжигания "хроматографического пика". Это позволило измерять ИС углерода в каждом индивидуальном соединении исходной пробы. Преимущества такого аппаратурного сочетания будут ясны из приводимых ниже примеров.

Пищевую двуокись углерода получают очисткой СО2, образующегося при сжигании природного газа. Углекислый газ в шампанском или пиве возникает при брожении виноградного сока или ячменя, где его источниками служат растения с резко отличным от природного газа ИС. Самая очевидная область применения излагаемого метода - выявление фальшивого пива и шампанского, в которые для создания обильной пены добавляют СО2 (газируют). Также резко отличается ИС углерода в получаемом из этилена синтетическом спирте и спирте пищевом.

Объектами измерения ИС сегодня выступают напитки, наркотики, взрывчатые вещества, пищевые добавки, растительные масла и др. На сегодняшний день эта аналитическая методика является рутинной в США и Европейских странах. Государственные стандарты по анализу соков и вин приняты Европейским Союзом и являются обязательными для всех входящих в него стран.

Прибор, решающий подобные задачи, должен определять ИС с точностью не хуже 0.1 δ, в пробе объемом 0.1 мл; обладать быстродействием, обеспечивающим измерение ИС за время прохождения хроматографического пика. Всем этим условиям отвечает масс-спектрометр для анализа стабильных изотопов H, C, N, O, S, Р, Si. Thermo Finnigan Deltaplus. Этот прибор может снабжаться устройствами для ввода пробы через газовый хроматограф, элементный анализатор (для газообразных, жидких и твердых проб) и многочисленные другие устройства.

Возможности применений анализа стабильных изотопов легких элементов далеко не исчерпываются описанными выше примерами. Этот метод начинает занимать ведущее положение в диагностике желудочно кишечного тракта. Прежде всего он дает быстрый и однозначный ответ на вопрос, инфицирован или нет пищевой тракт бактериями Helicobacter pylori, ответственными за такие заболевания, как язва желудка,язва 12-ти перстной кишки, колит, гастрит, злокачественные образования. При этом диагноз проводится по изотопному составу углерода в выдыхаемом пациентом углекислом газе. За полчаса до отбора пробы (10 мл выдыхаемго воздуха) пациенту дают выпить раствор мочевины (примерно 75 мг в 100 мл воды или сока), обогащенный изотопом 13С. Если бактерии присутствуют, то мочевина разлагается с выделением СО2, и это разложение фиксируется по изменению ИС углерода (если бактерий нет, то мочевина не разлагается). Эта процедура заменяет гастроскопию, проводится в амбулаторных условиях и требует всего полчаса. В настоящее время уреазный дыхательный тест (так называется процедура) прочно вошел в практику развитых стран. Для его проведения выпускается специализированный масс-спектрометр BreathMATplus. Использование других изотопно-меченных маркеров позволяет проводить функциональную диагностику печени, поджелудочной железы, отслеживать усвоение организмом углеводов, жиров, белков и др.